單細(xì)胞mRNA測(cè)序(scRNA-seq)允許分析異質(zhì)細(xì)胞群，提供解決各種生物和醫(yī)學(xué)問(wèn)題的令人興奮的可能性。最近開(kāi)發(fā)了一系列方法，因此有必要系統(tǒng)地比較它們的靈敏度，準(zhǔn)確度，精度和成本效率。
在這里，來(lái)自Ludwig-Maximilians大學(xué)的研究人員已經(jīng)生成并分析了來(lái)自479只小鼠ES細(xì)胞和加標(biāo)對(duì)照的scRNA-seq數(shù)據(jù)，這些對(duì)照用四種不同方法制備，每種方法分別進(jìn)行兩次重復(fù)。他們通過(guò)檢測(cè)基因的數(shù)量和它們捕獲加標(biāo)mRNA的效率，通過(guò)將加標(biāo)mRNA濃度與估計(jì)的表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)，通過(guò)功率模擬和方差分解的精確度以及它們的效率來(lái)比較它們的靈敏度。達(dá)到一定數(shù)量電力的成本。
實(shí)驗(yàn)和計(jì)算管道的示意圖
在2i / LIF和ERCC加標(biāo)RNA中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞用于制備單細(xì)胞RNA-seq文庫(kù)。這四種方法的不同之處在于獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符序列(UMI)的存在和長(zhǎng)度，允許鑒定cDNA擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的讀數(shù)。對(duì)于所有方法，比較地進(jìn)行細(xì)胞的數(shù)據(jù)處理和子集化。每個(gè)方法和重復(fù)的最終細(xì)胞數(shù)用它們的平均測(cè)序深度顯示。顏色代表比較的scRNA-seq方法：紫色 - CEL-seq，橙色 - Drop-seq，綠色SCRB-seq，藍(lán)色 - Smart-seq并且在本研究中使用。
雖然所有方法的準(zhǔn)確度相似，但研究人員發(fā)現(xiàn)微流體平臺(tái)上的Smart-seq是最敏感的方法，CEL-seq是最精確的方法，SCRB-seq和Drop-seq是最有效的方法。該分析為四種可用的scRNA-seq方法的選擇提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并為未來(lái)的方法開(kāi)發(fā)提供了基準(zhǔn)。
scRNA-seq方法的靈敏度
(a)不能分配給細(xì)胞條形碼(灰色)的總讀數(shù)百分比，不能映射到小鼠基因組(黃色)，
映射到外顯子(橙色)外部區(qū)域，內(nèi)部外顯子(藍(lán)色)和攜帶獨(dú)特的UMI(綠色)。(b)總共讀數(shù)超過(guò)100,000的所有細(xì)胞中至少有一次讀數(shù)的基因數(shù)。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，每個(gè)箱圖代表每個(gè)重復(fù)和方法的中位數(shù)，第一和第三個(gè)四分位數(shù)。(c)添加更多細(xì)胞時(shí)檢測(cè)到的累積基因數(shù)。(d)每種方法的靈敏度估計(jì)為檢測(cè)ERCC轉(zhuǎn)錄物的概率取決于其每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)。估計(jì)值的95%置信區(qū)間顯示為陰影區(qū)域。
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