單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(Single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)是在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)，原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞中微量的mRNA通過(guò)高效擴(kuò)增后再進(jìn)行高通量測(cè)序。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠有效解決組織樣本細(xì)胞異質(zhì)性以及常規(guī)RNA-seq被掩蓋的細(xì)胞群內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性難題，有助于發(fā)現(xiàn)新的稀有細(xì)胞類(lèi)型，并深入了解細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
基于10x Genomics最新Chromium系統(tǒng)利用油包水的微反應(yīng)體系，通過(guò)序列標(biāo)簽(cell barcode和UMI)區(qū)別群體中的不同細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄本，獲得單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜，可實(shí)現(xiàn)數(shù)千甚至上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞群體分析，解決常規(guī)scRNA-seq方法在通量或擴(kuò)展性方面存在的不足，為單細(xì)胞研究開(kāi)拓新的思路。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)優(yōu)勢(shì)
通量高，一次可以同時(shí)測(cè)8個(gè)樣本，每個(gè)樣本最多可以測(cè)10000個(gè)細(xì)胞
周期短，6分鐘內(nèi)完成上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞封裝，一天之內(nèi)完成細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞捕獲、擴(kuò)增以及建庫(kù)
捕獲效率高，單個(gè)細(xì)胞捕獲效率高達(dá)65%
應(yīng)用范圍廣，動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞均可以進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性、免疫細(xì)胞群體檢測(cè)以及胚胎發(fā)育等研究
技術(shù)原理
利用8通道的微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)，將含barcode的凝膠珠(Gel Beads)、細(xì)胞和酶的混合物、油三者混合，形成GEMs。
GEMs形成后，細(xì)胞裂解，凝膠珠自動(dòng)溶解釋放大量barcode序列，隨后mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有Barcode和UMI信息的cDNA，再構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序文庫(kù)。
建庫(kù)流程
案例展示
案例一 通過(guò)10× genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序繪制肺癌腫瘤微環(huán)境圖譜
Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment
研究背景
腫瘤周?chē)慕M織、免疫細(xì)胞、血管和細(xì)胞外基質(zhì)共同形成的腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲至關(guān)重要，本研究試圖通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示肺癌腫瘤微環(huán)境的特征。
技術(shù)路線(xiàn)
研究結(jié)果
文章共選取5例共19個(gè)樣本，通過(guò)10×genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探索基質(zhì)細(xì)胞的亞群分類(lèi)、基因功能(信號(hào)通路)、關(guān)鍵marker基因和臨床預(yù)后。共鑒定出52個(gè)基質(zhì)細(xì)胞亞群，反映了腫瘤微環(huán)境復(fù)雜性。對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的marker基因做生存曲線(xiàn)，發(fā)現(xiàn)這些marker基因可以作為肺癌預(yù)后診斷的潛在標(biāo)志物。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序常見(jiàn)問(wèn)題
1. 為什么每個(gè)樣品需要那么多的細(xì)胞量?
答：細(xì)胞在上機(jī)之前，需要對(duì)進(jìn)行一系列的質(zhì)檢，質(zhì)檢過(guò)程需要用掉部分細(xì)胞。
2. 如何檢測(cè)細(xì)胞活性?
答：可以使用臺(tái)盼藍(lán)染色，用顯微鏡觀察細(xì)胞活性。
3. 植物細(xì)胞能做單細(xì)胞測(cè)序嗎?
答：植物細(xì)胞可以做單細(xì)胞測(cè)序，但需要注意兩點(diǎn)：1. 需要注意細(xì)胞大小，10× genomics的適用對(duì)象是直徑小于40 nm的細(xì)胞。2. 植物細(xì)胞含有細(xì)胞壁，細(xì)胞壁對(duì)后續(xù)裂解有影響，所以需要用纖維素酶等消化細(xì)胞壁，制成原生質(zhì)體。
4. 單細(xì)胞測(cè)序需要和常規(guī)轉(zhuǎn)錄組一樣設(shè)置重復(fù)嗎?
答：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序的目的是分離群體細(xì)胞中的不同亞群，表征這些亞群的特征，我們建議老師最好有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，但一般對(duì)生物學(xué)重復(fù)沒(méi)有要求。
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