細胞是生物結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，種類和狀態(tài)差異很大。在大多數(shù)生物系統(tǒng)中，我們對細胞多樣性的認識不完整，對于像神經(jīng)系統(tǒng)(腦細胞)這樣的復(fù)雜組織 。單細胞身份和功能的表征，作為對每個細胞功能能力和反應(yīng)的理解細胞類型，將加速生物學(xué)發(fā)現(xiàn)。它可能用于癌癥，用于腫瘤，幾乎任何可能在細胞群體中具有多樣性的物體。然而，今天的技術(shù)并沒有提供足夠簡單的方法來同時分析大量的單個細胞。
這樣，需要快速，可擴展的方法來表征具有許多細胞類型和狀態(tài)的復(fù)雜組織。
DROP-SEQ的原則和優(yōu)點：
Drop-Seq是基于使用微流控技術(shù)快速分析數(shù)千個單個細胞的策略，通過將它們封裝在微滴中進行并行分析。
這些納升級水相室已被用于微流體裝置中的許多應(yīng)用：納米制造，乳液和泡沫，藥物遞送，但也作為用于PCR 和逆轉(zhuǎn)錄的微小反應(yīng)室 。Drop-Seq使用液滴將細胞劃分為納升級大小的反應(yīng)室，用于分析它們的mRNA轉(zhuǎn)錄物，同時使用分子條形碼策略記住轉(zhuǎn)錄物的起源細胞。利用這種技術(shù)，一位科學(xué)家每天可以同時制作10 000個單細胞文庫，同時進行廉價且簡單的實驗。因此該方法將允許為已知的細胞類別和新的候選細胞亞型創(chuàng)建基因表達的分子圖譜。
Drop-seq利用微流體的優(yōu)勢在于：
·高吞吐量在短時間內(nèi)產(chǎn)生;
·盡量減少昂貴樣品的消耗;
DROP-SEQ包含以下步驟
·從組織中制備單細胞懸液
·準備條形碼的引物(無論是在微粒的表面，內(nèi)部)
·使用微流體裝置將每個細胞分別與微滴中的明顯條形碼化的微粒共同封裝
·一旦在液滴中分離，裂解細胞，釋放它們的mRNA，然后與引物雜交
·打破水滴并產(chǎn)生STAMPs(附著于微粒的單細胞轉(zhuǎn)錄組)
·放大STAMP
·測序和分析：使用STAMP條形碼來推斷每個轉(zhuǎn)錄本的原始細胞
Drop-Seq可以使用兩種類型的珠子：
A. “簡單”微粒
B. 水凝膠微粒
DROP-SEQ使用簡單的微粒
1.從復(fù)雜的組織中制備單細胞懸液
一個復(fù)雜的組織被分解成單個細胞。
2.引物合成
微粒上的引物序列
每個微粒含有超過10 的8次方個獨立的引物，它們共享相同的“PCR處理”和“細胞條形碼”，但具有不同的獨特分子標識符(UMI)。實際上，PCR處理是在所有引物和珠子上相同的恒定序列，其允許STAMP形成后的PCR擴增。細胞條碼只在相同微粒的所有引物中相同，但與其他珠子上的細胞條碼不同，允許恢復(fù)細胞的來源。每個引物上不同的UMI允許mRNA轉(zhuǎn)錄物進行數(shù)字計數(shù)并識別PCR重復(fù)。最后，在所有引物序列的末端存在30-bp oligodT序列以捕獲mRNA并啟動逆轉(zhuǎn)錄。
合成一個獨特的分子標識符(UMI)
UMIs的合成發(fā)生在“分裂和合并”合成周期完成之后。所有微粒一起進行八輪簡并合成，每個循環(huán)期間可用全部四種DNA堿基，使得每個單獨的引物接收4,8 (65,536)個可能序列(UMI)中的一個。
3.微流體裝置
一旦單細胞懸液和微粒準備就緒后，使用定制設(shè)計的微流體裝置將單個細胞與微粒一起封裝在液滴中。
該裝置在將它們分隔成不連續(xù)的液滴之前將兩個水流連接起來。層流防止在液滴形成之前混合兩種含水輸入物。一個流體包含細胞，另一個流體包含懸浮在裂解緩沖液中的條形碼化的引物珠粒。
微流體設(shè)置
用于Drop-Seq的微流體裝置的示例
流量
油：15,000μl/小時=250μl/分鐘
細胞：4,000μl/ hr?66,7μl/ min
珠粒：4,000μl/ hr?66,7μl/ min
組件列表
§ 倒置顯微鏡
§ 壓力控制器+ 3流量傳感器/三個注射泵
§ 3個falcon管/ 3mL注射器
§ 磁力攪拌系統(tǒng)
§ 微流體管用于設(shè)置元件的流體連接§ 微流體配件和連接器
§ PDMS共流微流體微滴生成裝置
§ 100微米細胞過濾器的珠子
§ 40微米細胞過濾器的細胞
§ 計數(shù)室
4.細胞裂解和RNA雜交
緊接著液滴形成后，每個細胞在液滴內(nèi)裂解并且其mRNA釋放。然后它們與其伴侶微粒表面上的引物雜交。
5. STAMPS一代
為了一次有效地生成數(shù)千個STAMP，通過添加試劑來破壞液滴以使油 - 水界面不穩(wěn)定，并且收集微粒并洗滌。然后將mRNA在一個反應(yīng)中一起逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，形成稱為“附著于微粒的單細胞轉(zhuǎn)錄組”的(STAMP)的一組珠子。
6. STAMPS的放大
然后可以通過PCR反應(yīng)對帶有條形碼的STAMP進行擴增以進行高通量mRNA測序，以分析任何期望數(shù)量的單個細胞。
7.測序和分析
使用高容量并行測序從每個末端對得到的分子進行測序。讀數(shù)首先與參考基因組比對以鑒定cDNA的來源基因。接下來，通過它們的細胞條形碼來組織閱讀，并且每個細胞中確定的每個基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量被數(shù)字計數(shù)。這就是UMI起作用的地方，避免從相同的mRNA轉(zhuǎn)錄物中重復(fù)計數(shù)序列讀數(shù)。然后可以建立數(shù)字基因表達測量矩陣(每個基因每個細胞一個測量)用于進一步分析。
液滴下使用水凝膠微粒
關(guān)于使用水凝膠珠，操作原理或多或少保持不變，即最大的區(qū)別涉及引物，它們位于微粒內(nèi)部而不是在其表面。
為此，微流體裝置由三個通道而不是兩個組成：
§ 一個帶來珠(這整個過程的關(guān)鍵)
§ 將細胞帶入液滴中的一種
§ 一個帶來我們需要進行分析的化學(xué)試劑
至于“簡單微粒”的使用，水凝膠珠含有可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物，其隨后將條形碼液滴內(nèi)細胞的內(nèi)容物條碼化。因此獲得了作為RNA序列拷貝的DNA序列集合，并且這些序列現(xiàn)在通過它們來自何處而被分類。
然后，有可能破壞液滴并將整個細胞群作為批量樣品處理，因為知道每個細胞都被單獨條形碼化。
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